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专题文章

确定原始的美国PED病毒PC22A毒株的感染滴度和毒力

2016年 1月 29日 星期五

猪流行性腹泻(PED)是猪的一种高度传染性肠道疾病,典型症状是急性水样下痢、呕吐、脱水和体重丧失。它是最先于1971年在英格兰的家猪中发现的,俄亥俄州立大学的Xinsheng Liu等人写道。

翻译:温鹏

致病病原PED病毒是1978年被鉴定的。之后,PED在欧洲各国出现大流行并造成猪的死亡,直到1980年代末。之后,PED病毒在欧洲更多呈地方性发病。

在亚洲,大流行造成哺乳仔猪大量损失的事件初次见报是在1982年,持续到1990-2000年代。

从2010年10月以来,中国报导了多次严重的PED大流行暴发,感染所有日龄的猪只,但典型情况下哺乳仔猪的死亡率会很高,造成严重的经济损失。

2013年4月PED病毒出现在美国的猪群里,并在该国全境迅速扩张,导致2013-2014年800万头猪死亡,并造成9-18亿美元的经济损失。

采用剖宫产初乳剥夺(CDCD)限菌猪和常规猪对原始美国PED病毒分离株的致病机理进行了研究。

与现场观察相符,原始美国PED分离株为高度致病,在哺乳仔猪当中造成100%的发病率和50-100%的死亡率。

在某些猪场,通过回喂粪便材料和/或感染仔猪的肠道组织故意让妊娠母猪接触病毒,可刺激母源免疫,并缩短了暴发周期。然而,PED病毒的暴发仍然在美国持续。迫切需要有效的疫苗用来预防PED。

为了评估疫苗的活体效果,就需要采用标准化的、有效的PED病毒对来自免疫母猪的仔猪进行攻毒。截至目前,需要获得关于合并PED病毒挑战的感染滴度、以及标准PED病毒接种规程的信息才能评估PED病毒疫苗的药效。

在本研究当中,通过4日龄CDCD仔猪对原始美国PED毒株PC22A的猪腹泻中位剂量(PDD 50)进行了确定。同时,对急性临床症状和病例损伤进行了研究。动物的使用规程经过了俄州大“农业动物护理与使用委员会”的审查和批准。

找到了四头所在猪群无先前PED暴发史、并且PED病毒血清学检测(明尼苏达大学兽医诊断实验室)结果阴性的PED幼稚经产母猪(A、B、C、D)。

对她们进行剖宫产,以便获得CDCD猪(n=53)。出生当天给仔猪饲喂牛初乳替代品(AgriLabs,美国密苏里州圣约瑟夫),此后在第三天之内逐渐替换为全奶(Parmalat, Parmalat美国公司)。

整个试验期间按兽医处方使用了抗生素(青霉素[VET一,英国]、庆大霉素[VET一,英国]和新霉素[MED-PHARMEX, Pomona,美国加州])、抗毒素(梭菌抗毒素[葆灵格英格翰首要,圣约瑟夫])和益生菌(益生菌,Chr. Hansen, 美国威斯康星州梅诺莫尼)以便防止仔猪的机会病原感染。

所有仔猪随机分配到8个剂量组(G1-G8)当中,以及两个安慰剂对照组(表1)。每头仔猪养在单个钢笼里,同组猪养在地上3层猪笼里(每层2-4笼)。猪笼房间为生物学安全级别II级(BSL2)。相邻两个剂量组的猪养在同一房间的不同侧(5.4 × 3.0 m 2 )。

表 1.

猪分组和对应编号、接种物以及接种后猪的腹泻结果

分组

头数

接种物稀释 a

接种物感染滴度计算值(log 10 PFU/mL) b

接种物RNA滴度计算值 (log 10 GE/mL) b

腹泻(比例) c

粪中RNA排毒(log 10 GE/mL)

G1

4

10-3

4

10

4/4 (100)

11.8-13.0

G2

5

10-4

3

9

5/5 (100)

12.5-12.9

G3

5

10-5

2

8

5/5 (100)

12.0-13.4

G4

13

10-6

1

7

13/13 (100)

9.8-13.3

G5

8

10-7

0

6

8/8 (100)

11.5-13.7

G6

5

10-8

-1

5

2/5 (40)

11.4-12.4

G7

4

10-9

-2

4

0/4 (0)

-d

G8

5

10-10

-3

3

0/5 (0)

-

对照 1g

2

PBS

-

-

0/2 (0)

- or 5.0

Control 2

2

PBS

-

-

0/2 (0)

-

PEDV-幼稚母猪E产出的一窝仔猪

12

10-5(100 PDD50)

2

8

12/12 (100)

11.8-13.0

先前暴露PEDV的母猪F产出的一窝仔猪

13

10-3 (10,000 PDD50)

4

10

0/13 (0)

5.1-8.9 e

先前暴露PEDV的母猪G产出的一窝仔猪

10

10-4 (1,000 PDD50)

3

9

0/10 (0)

4.9-5.5 f

a每头猪口服接种 3 mL接种物。

b滴度根据原始病毒合并样本滴度和稀释倍数计算。

cG1-G8和对照组以及常规的E母猪组接种后24小时,以及常规母猪F和G组接种后7至9天,粪便评分分别确定为3分。

dRT-qPCR阴性或低于量限(4.8 log10GE/mL).

e10头猪数据,检测为阳性。

f2头猪数据,检测为阳性。

g对照1组仔猪,与G5仔猪养在同一栋猪舍。

在一头限菌(Gn)猪体内制备PEDV PC22A毒株的病毒池,制备过程在我们的先前研究中有描述。对组织培养驯化PC22A第二代继代(P2)进行蚀斑纯化,选出一个蚀斑在Vero(绿猴肾)细胞中做进一步扩增(总共P3)。它被用作接种物(5log10蚀斑-形成单元[PFU]/ml),对一头19日龄Gn猪进行口服攻毒。

接种1天之后(1dpi),当它表现水样下痢的时候,将这头猪安乐死。采集该仔猪的小肠和大肠内容物,混合并在−80 °C条件下保存在1ml容积的试剂管中作为病毒池。

如报告采用蚀斑分析和定量实时逆转录-PCR(RT-qPCR)进行检测,该病毒池的感染滴度和RNA滴度分别为7.75 log 10 PFU/mL和13 log 10 基因组当量 (GE)/mL。

猪的接种物制备方面,采用1ml的PC22A病毒池,采用磷酸缓冲盐(PBS,pH7.4;密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)1:10稀释,混合均匀。悬浮液在4 °C条件下2095 × g下离心10分钟,取上清液作为1:10 (10 −1 )稀释液。之后,在PBS中进行10倍序列稀释(10 −2 -10 −10)。

4日龄上,每个试验组(G1-G8)仔猪口服接种3ml的10倍序列稀释(10 −3 -10 −10 )病毒。对照组接受PBS(表1)。

接种之后,每天4次观察仔猪临床症状,包括腹泻。每天对所有仔猪采集直肠涂样,并对粪粘稠度进行评估:0 = 正常; 1 = 糊状; 2 = 半液态; and 3 = 液态。评分为3分即视为水样下痢。

确定了猪中位腹泻剂量(PDD 50),方法是用Reed-Muench法计算给定时间内一半以上仔猪出现水样下痢的病毒稀释倍数。

为了降低猪之间交叉污染的风险,PEDV PC22A接种的CDCD仔猪一出现水样下痢就被安乐死,并实施尸检。取十二指肠、控场、回肠、盲肠、结肠和肠系膜淋巴结,如前述固定在10%中性缓冲福尔马林溶液中留作组织病理学检查。

对每段空肠,用计算机图像系统(PAX-it软件、PAXcam、Villa Park,美国伊利诺州)对10个茸毛和隐窝进行测量。计算了茸毛高度和隐窝深度比(VH:CD)。

同时,通过免疫组化试验,采用鼠单克隆抗体(SD6-29)(由南德科塔州立大学的Steven Lawson和Eric Nelson赠送)对PED病毒核壳体(N)蛋白进行了检测。

因为常规哺乳仔猪是未来疫苗研究的目标,所以选择了PED病毒幼稚经产母猪E,并且给她自然分娩的哺乳仔猪4日龄口服接种PC22A,每头仔猪100 PDD 50,以便验证CDCD猪试验的结果。

此外,从最近暴发 (2014年7月19日)过PED的猪场获得两头接触过病毒并且已经康复的经产母猪F和G,在产前73至75天连续3天(2014年7月20-22日)暴露接触活病毒。通过PED病毒特异性细胞培养免疫荧光试验(CCIF)和空斑病毒中和(PRVN)试验对F和G母猪进行检测,方法如描述,二者PED病毒特异抗体IgG、IgA和病毒中和抗体在暴发后53天(产前22-23天)均为阳性。

F和G母猪通过自然分娩分别产出13和10头仔猪。仔猪和它们的母猪在单独的房间里养在一起。4日龄的时候,分别给F和G母猪的仔猪口服接种10 000 PDD 50和1000 PDD 50。分别在7 dpi和9 dpi,对仔猪和它们的母猪实施安乐死。

表 2.

现场条件下接暴露触过PED病毒的母猪F和G的血清和乳汁样本中特异性IgG、IgA和病毒中和(VN)抗体水平

检测样本

分娩前 a

仔猪接种后 a

母猪 F

母猪 G

母猪 F

母猪 G

血清

IgG

128

64

128

128

 

IgA

32

32

8

16

 

VN

147

222

128

128

IgG

NA b

NA

1024

1024

 

IgA

NA

NA

512

128

 

VN

NA

NA

1351

675

a母猪F和G的血清分别于分娩前20-22天和接种后7至9天采集。母猪F和G的仔猪分别于4日龄按10 000和1000 PDD50接种。母猪F和G的乳样于接种后1天采集。

bNA: 不适用。

在病毒接种之前,直肠涂样或肠溶物的猪流行性腹泻病毒RNA粪中排毒为阴性,并且对G1-G6 CDCD仔猪(10 −3 -10 −8稀释病毒),在1 dpi转为阳性,滴度范围9.8-13.7 log 10 GE/mL(表1)。

到1 dpi时,G1至G5当中100%仔猪表现下痢,G6仔猪40%(2/5)下痢,G7和G8(10 −9 and 10 −10稀释病毒)和对照组1、2无下痢。对照组1的2头仔猪与G5(10 −7稀释病毒)仔猪养在同一房间。它们在1 dpi时临床表现健康,但2 dpi上表现水样腹泻。

对照1组的两头猪分别于1和2 dpi排出病毒RNA。这些结果显示,在同屋这两组(G5和对照1)仔猪之间发生了PED病毒的交叉感染。

确定PDD 50的时间分界点设定为1 dpi,检测结果为7.83 PDD 50 /3 mL,对应于7.35 log 10 PDD 50 /mL。它和通过蚀斑试验确定的细胞培养感染滴度(7.75 PFU/mL)相似。对照组2的两头仔猪在3 dpi上未观察到临床症状,也未检到PED病毒RNA排毒。

显微方面,接受相同病毒剂量的同组CDCD仔猪之间在1-3 dpi表现了不同阶段的茸毛萎缩(图 1A-D)。在某些仔猪当中,茸毛略有缩短,但茸毛上皮细胞的外形总体完整(图1A-B)。

在另一些情况下,茸毛显著缩短,伴有肠细胞脱落和空泡(图1C)。随着茸毛萎缩趋于严重,整个小肠的茸毛变钝并融合(图 1D)。

然而,在接受不同PED病毒抗原剂量的各组当中,茸毛萎缩的程度无显著差异。

总体上,大部分(40/49,82%)PED病毒接种CDCED仔猪的平均空肠VH:CD比值都<2。相比之下,对照组2的两头对照仔猪的平均空肠VH:CD比值分别为7.16 ± 1.25和7.80 ± 0.60。


图 1. 采用鼠康PED病毒核壳体单克隆抗体 (SD6-29)进行的免疫组化(IHC)染色来检测PEDV PC22A感染。

PED病毒抗原的指示为棕色,在PEDV PC22A接种CDCD仔猪(A-D)空肠中段的全部茸毛上皮细胞中都检测到。观察到茸毛变短和融合,伴有肠细胞脱落(C、D)。取决于PED病毒感染的进展,感染了PED病毒的茸毛上皮细胞会仍然构成茸毛(B)、脱落、肿大或经历坏死(C),或高度弱化(D)。在从CDCD(E)和常规(F)蜘蛛获得的回肠当中,PED病毒抗原扩展到茸毛/隐窝边界,并且散步在隐窝细胞层(CCL)。大部分残留上皮细胞为PEDV阳性。此外,从来自PED暴露并恢复的母猪(G)的常规PED病毒接种仔猪获得的控场穹顶区的很少的单核细胞中检到了PED病毒抗原。在安慰剂接种CDCD仔猪(H)的空肠中未见到PED病毒抗原。原始放大倍数: × 40 (A), × 200 (B-H)。

在来自对照2组的2头仔猪的组织当中,通过IHC(图 1H)未检到PEDV N蛋白。然而,对于PEDV接种猪,整个小肠均呈PEDV N蛋白阳性,主要在茸毛尖端和侧壁上、直到茸毛/隐窝边界处的肠细胞的胞浆里检测到(图 1A-B)。

较少情况下,在李氏肠腺隐窝的里面或附近也观察到PEDV阳性细胞(5/49,10%)(图 1A-B)。有些情况下在VH:CD比相对较高(2.54至5.17)的情况下会检到最密集的IHC指示(图 1A-C)。随着茸毛萎缩的加重,茸毛上皮细胞总数和PEDV阳性细胞数会急剧减少(图 1D)。在6/49(12%)PEDV接种CDCD猪(数据未展示)的结肠上皮当中检到散发PEDV抗原病灶。

PED幼稚母猪E的那12头仔猪在1 dpi上表现了水样下痢,以及高水平的PED病毒RNA排毒(11.8-13.0 log 10 GE/mL)。1至5 dpi之间死亡或安乐死的仔猪的VH:CD平均比值在0.48 ± 0.12至1.57 ± 0.32之间,除了5 dpi安乐死的一头仔猪表现了相对较高的VH:CD平均比值(2.29 ± 0.64)。

PED病毒抗原分布的规律与CDCD仔猪中观察到的类似(数据未展示)。注意到一头5 dpi安乐死的常规仔猪(1/8)隐窝上皮细胞退化,含有大量PEDV N抗原。

F和G母猪的仔猪7 dpi和9 dpi未表现下痢。F(3/13, 23%)和G(8/10, 80%)母猪的部分仔猪粪中没有排毒,其它仔猪有排毒,滴度较低(4.9-8.9 log 10 GE/mL)(表 1)。

安乐死时(7或9 dpi)采集的F和G母猪的血清样本的PEDV特异性抗体滴度和产前滴度相似,符合母猪由于仔猪保护而缺乏PED重新刺激的情况(表2)。1 dpi采集的F和G母猪的乳样PEDV特异性抗体滴度(F母猪IgG 1024,IgA 512,VN 1351;G母猪IgG 1024,IgA 128,VN 675)比血清样本高得多(表2)。

在7或9 dpi上,F和G母猪的仔猪当中未观察到显著的组织病理学损伤。在场粘膜下层/集合淋巴结的个别单核细胞当中检到PEDV N蛋白,但肠茸毛上皮细胞中未检到(图 1G)。

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