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专题文章

在qPCR流程中加入VetMAX Xeno IPC一次获得正确结果

2016年11月 2日 星期三

获得美国兽医协会实验室诊断 (AAVLD)指南推荐,VetMAX Xeno IPC可为兽医实验室提供迅速的、可靠的、使用方便的解决方案来提高qPCR作业的效率和精度。

翻译:温鹏
Thermo Fisher Scientific

这种Applied Biosystems(应用生物系统)™ VetMAX™ Xeno™的内部阳性对照(IPC)检测用来监控裂解后样本的制备过程,并且在整个样本制备规程中为核酸的恢复提供对照。方法是将已知拷贝数的IPC加入样本溶解反应中,并通过与一个阴性提取对照对比恢复率来分析下游的PCR数据。

这个Xeno(异种)™检测被开发用来在一个包含宿主和病原核酸的背景下检测那种Xeno™ IPC (RNA或DNA)。这种检测含有有限浓度的引物和探针,它们可以由一种主要目标检测来扩增。由于IPC只是作为对照,因此Xeno检测不应干扰主要目标核酸的检测就很重要。该Xeno 检测是专门针对该Xeno-IPC (RNA或DNA)设计的。

该Xeno IPC使用指南(样本制备)


该Xeno IPC已经在130 μL至700 μL裂解液、经过20,000拷贝/次反应的条件下经过检测。这个浓度可确保该检测足够敏感,可以在普通(也就是非抑制性)样本中按一致的Ct范围检测Xeno IPC。采用Applied Biosystems™试剂和工作流程的条件下,Xeno IPC的检测范围期望是27-34Ct

为了针对你的特定的样本制备来优化Xeno IPC,必须考虑下列方面。

  1. 该Xeno IPC按10,000 copies/μL提供,建议每次反应加入2 μL (20,000拷贝)。这是按裂解液体积130 μL至700 μL计算。如果你的裂解液容量超过1ml/反应,那么请考虑添加更多的Xeno IPC,以便对稀释因素进行补偿。作为总原则,20,000拷贝/ml裂解液应该就够了。
  2. 该Xeno IPC由未保护核酸构成。这意味着它没有蛋白质外壳来保护它免受样本基质中核酸酶的作用,从而容易降解。为了维持Xeno IPC的完整性,它必须加入含有某种核酸保护剂的溶液中,例如基于胍盐的裂解液。
  3. 该Xeno IPC被设计为对抑制剂敏感。如果样本基质含有高浓度的抑制剂,那么Xeno IPC可能无法扩增。有效的核酸分离和提纯方法将降低抑制的影响。


Xeno检测(实时PCR)使用指南

为了针对你的特定的实时PCR需要优化Xeno检测,可考虑下列方面:

  1. Xeno检测设计用来与你的目标检测一起扩增。它应该不会干扰你的目标检测。
  2. Xeno检测购买时可配备VIC™或LIZ™报告基团染料。根据扩增中的主目标染料,这可以提供一些灵活性。
  3. 该Xeno检测作为25X混合提供,因此每个25 μL反应包括1 μL的Xeno检测。

优化你的Xeno扩增检测

下列是如何与Xeno检测一起优化你的目标检测的扩增过程的建议。请注意,在优化任何扩增检测的时候都可以采取相同规程。

  1. 用你的目标RNA或DNA准备一幅5-8点的标准曲线,确保包含足够的稀释点来覆盖你的目标检测的检测极限(LOD)附近的浓度。例如,如果LOD是50个拷贝/反应,你就需要稀释到100拷贝/反应、50拷贝/反应,以及25拷贝/反应。每个稀释点用三个重复来测定。
  2. 为了确定扩增过程中Xeno检测是否会对目标检测的敏感度造成影响,可以在带Xeno检测扩增和不带Xeno检测扩增的目标检测中测试标准曲线。实施这个实验的时候必须考虑到下列各点。
    1. 建议按一套浓度将Xeno IPC加入到每个标准曲线翻印当中,以便某个第二性的目标(也就是Xeno IPC)可以被确定出来。为了确定加入每个标准曲线反应的那套浓度,首先要计算Xeno IPC的最大拷贝数,可以用样本制剂的洗脱级来估计。例如,如果每个样本制剂反应中加入 2 μL的 Xeno IPC,并且在80 μL中洗脱,那么估计最大浓度为250个Xeno IPC拷贝/μL(2 μL x 10,000拷贝/μL = 20,000 拷贝; 20,000拷贝/80 μL = 250拷贝/μL)。
    2. 之后,为了确保Xeno IPC添加的一致性并且便于设置,建议将Xeno IPC直接加入PCR mastermix溶液当中。采用上述样本,一个典型的5 uL样本输入的PCR反应会产生出最终浓度为1,250拷贝/反应的Xeno IPC(250拷贝μL x 5 μL = 1,250拷贝/反应)。
    3. 从浓度为10,000拷贝/μL的Xeno IPC原液用核酸缓冲液制备一个1:8* 稀释液,来制备一种工作储备液,浓度为1,250* 拷贝/μL。从这个Xeno IPC工作储备液,加1 μL到你的master mix的每个反应当中,达到1,250*拷贝/反应的最终Xeno IPC浓度。参考下列(表 1)的master mix配方,作为反应设置的指南。 
      * 根据2a和2b的计算,数字可能有变化。
  3. 根据表1制作两个独立的master mix溶液。一个master mix将含有目标-Xeno检测扩增,一个将只含有目标检测。
    1. 根据反应板设置(表2),在每个井孔20μL的master mix溶液中加入5 μL的标准曲线稀释液。向你的NTC(无模板对照)中加5 μL的Xeno IPC稀释至1,000拷贝/μL,作为你的Xeno IPC阳性对照,5 μL目标阳性对照,以及5 μL无核酸酶的水,如表2所示。
  4. 运行qPCR,采用为你的检测推荐的温度曲线。

分析

  1. 根据你的检测规程确定每种目标燃料的阈值设置。
  2. 对于Xeno检测,我们建议把阈值设为稀释至1,000 拷贝/μL的该Xeno阳性PCR对照的最大ΔRn的10%。例如,如果Xeno阳性PCR对照的最大ΔRn值为2.45,那么就把阈值设为0.245。
  3. 比较你的目标检测的扩增带与不带Xeno检测情况下的敏感度(可检出的稀释倍数)。在Xeno检测存在的情况下目标检测的敏感度应该保持相同;两个master mix溶液之间的LOD应该相当。
  4. 检查阴性对照(NTC),确保当目标和Xeno检测在扩增的过程中没有出现任何非特异性扩增。
  5. 如果结果令人满意,你可以用现场样本来测试目标和/或Xeno检测扩增来验证可用性。否则,请参考Xeno IPC故障排除和检测指导部分。

故障排除

关于产品故障排除请参考Xeno IPC与检测指导。

更多信息请访问thermofisher.com/xeno-ipc

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