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专题文章

饲料中防止PED污染的方法比较

2016年11月 7日 星期一

猪流行性腹泻(PED)病毒感染会造成腹泻、呕吐以及哺乳仔猪的高死亡率。污染的饲料据认为是传播PED病毒的载体。本研究的目的是比较加热、电子射线处理、以及添加饲料添加剂等方法灭活饲料中的PED病毒的效果,明尼苏达大学的Michaela P. Trudeau等人写道。

翻译:温鹏

简介

PED病毒是一种多态、有壳的RNA病毒,属于冠状病毒科Coronaviridae的一种冠状病毒。该病毒第一次获得鉴定是1978年比利时的一家种猪场的一次痢疾暴发当中。感染PED病毒之后,哺乳仔猪会发生腹泻、呕吐,伴有高死亡率。自从PED病毒第一次被鉴定出来之后,它已经在加拿大、韩国、中国、泰国、意大利、匈牙利以及越南等国见报。有一个要点需要指出,中国和越南是亚洲最大的两个养猪国,而这两个国家都受到了PED病毒的影响。

在美国,这种病毒是2013年4月第一次检到的,从那以后已经在17个州造成了很高的仔猪死亡率。有人提出,PED病毒是通过污染的饲料传播的。尽管研究显示PED病毒在饲料和饲料原料当中的存活能力有限,但对各种饲料加工处理以及它们在全价猪饲料当中灭活该病毒的效力进行对比的数据很有限。

在饲料和饲料原料行业内,温度和时间条件与采用的加工方式有关,例如,制粒、炼油、巴氏消毒、或喷雾干燥等。饲料的水分含量以及原料还受到加工方式类型的影响。而温度、时间、以及湿度的互动也对饲料中病毒的灭活有影响。来源于猪的原料被认为对疾病的传播具有最大的风险。在动物饲料中使用炼制饲料原料的时候,加工条件会取决于新鲜材料的组成。总的来说,全国炼油者协会建议,大部分炼油系统采用115°C至145°C炼制40至90分钟。这样的温度被认为能够有效杀灭沙门氏菌属的病原。类似地,带壳的古典猪瘟RNA病毒也可以在71°C下仅仅1分钟的巴氏消毒过程中被灭活。在其它过程中也会采用高温(100°C)左右,例如禾谷饲料的微粉化加工过程。在加工炼制产品以及禾谷饲料的过程中的高温也可能能够有效灭活污染饲料中的PED病毒,但没有任何研究比较过PED病毒在高于80°C的温度条件下的存活率。

其它加工过程,例如离子化辐射,据显示能够降低饲料中病原的存活率,尤其是家禽饲料中的李氏单胞菌。最近,离子化辐射技术,例如电子射线(eBeam),现在被用在食品与饲料的例行消毒过程,杀灭其中的病原。eBeam技术的主要特征包括无热(因此减少养分损失)、使用商业电(不依赖于放射性同位素)、处理迅速、以及能够精确控制剂量。美国食药管理局(FDA)已经批准最高达到50kGy的这种过程用于食品和动物饲料的处理。这些都使得eBeam技术在广泛应用领域里都有很大的吸引力,包括动物饲料消毒。

除热处理和eBeam处理之外,特定的有机酸饲料添加剂,包括丙酸、甲酸、丁酸等,过去在抗菌方面都有应用。这些添加剂先前都曾被用来控制病原,例如禽饲料中的沙门氏菌和大肠杆菌,以及其它病原。然而,尚未考察有机酸以及其它添加剂的效果,例如饲料中的糖和盐。因此,本研究的目的就是确定加热或非加热灭菌方法,以及使用选定饲料添加剂,能否降低试验条件下污染的猪饲料当中PED病毒的存活率。

材料与方法

病毒与病毒恢复

选用NVSL(依阿华阿莫斯国家兽医服务实验室)PED毒株进行扩增,并在Vero-81(非洲绿猴肾,ATCC® CCL-81™)细胞中进行滴定。我们已发现,Vero-76和Vero-81细胞均易感PED病毒。我们本研究中选用了Vero-81。细胞在含8%牛胚胎血清(FBS;美国纽约州格兰德岛Gibco生命技术公司)、50 μg/mL 庆大霉素(Mediatech)、150μg/mL硫酸新霉素(Sigma,美国密苏里圣路易斯)、1.5μg/mL两性霉素(Sigma)、以及455μg/mL链霉素(Sigma)的杜氏改良依格尔培养基(DMEM;美国弗吉尼亚州Herndon的Mediatech)中生长。细胞用磷酸盐缓冲液冲洗三次(PBS;pH7.2)。病毒接种之后,细胞37°C孵化1小时,采用维护培养基实现病毒吸收(加庆大霉素、硫酸新霉素、两性霉素、链霉素和10μg/mL胰蛋白酶的DMEM)。接种60分钟之后再对细胞进行冲洗。冲洗媒介为不含胰蛋白酶的汉克平衡盐液。然而,维护培养基含有胰蛋白酶。接种细胞37°C下在5%CO2环境下进行孵化。每天用倒置显微镜对病毒造成的细胞病例影响(CPE)进行检查,直到感染后5天。将感染细胞进行三次冷冻-解冻周期(-80°C/25°C)以便对病毒进行收获,之后 4°C温度下2500 × g加速度离心15分钟。上清液吸入50ml管,-80°C保存直到使用。

在所有实验当中,经过某种特定处理之后的存活病毒被恢复到一个牛肉提取物(实验室科技公司,新泽西海蓝德)在0.05M甘油(Sigma)中的3%浓度、pH 7.5的洗液当中。洗脱之后,将洗液2500 x g离心10分钟,去除有机质/杂质。取上清液用来确定存活病毒数量,假如有的话。为了对病毒汤以及其它样本中的PED病毒进行滴定,将DMEM(维护培养基)当中制备的十倍系列稀释的洗液接种到单层Vero-81的96井微量滴定板(Nunc,美国纽约)上,100 μL/井,3井/稀释。接种细胞37°C下在5%CO2环境下孵最多七天,直到CPE出现。表现CPE的最大稀释就是滴定终点。采用Karber法计算培养组织感染剂量 (TCID50/mL)作为病毒滴度。将存活病毒与初始病毒滴度进行比较,计算灭活病毒数量,并用对数标度(log10 TCID50/mL)表示。

热处理对PED病毒的灭活

采用某个II阶段全价猪开食料(CGI,强化NP-NT,批号831458),经RT-PCR证实PEDV阴性。表1展示本饲料样本的近似分析结果。饲料(5g)等分试样在玻璃烧杯中制备,然后放到干燥炉中设定120、130、140和145°C。饲料试样放在干燥炉里30分钟,达到干燥炉温度。饲料达到指示温度之后,立即将烧杯移除,加入1ml的先前放置到室温的PED病毒(6.8x103 TCID50/ mL)。混合之后,将烧杯放回设定为适宜温度的干燥炉中,孵化0, 5, 10, 15, 20, 25,和30分钟。经过孵化阶段之后,将样本从炉中取出,用风扇主动冷却15分钟,用该3%牛肉提取物洗脱溶液洗脱,对存活的病毒颗粒进行滴定。每个温度的三个重复,结合用于一个单一的滴定并进行细胞接种。试验重复实施。

表 1. 试验中使用的Vita-Plus CGI强化饲料的近似分析。

eBeam处理对PED病毒的灭活

实施了初步剂量绘图试验,用来计算样本的剂量整齐度。通过每个试验的最大剂量/最小剂量来计算整齐度。理想情况下,该剂量整齐度比(DUR)应该大致为1.0。在用eBeam技术对动物饲料进行商业性处理的时候,最终包装的大小需要优化,以便保障剂量整齐度。这种优化涉及调整大小和重量,以便确保eBeam电子有足够的穿透,而且整个包装内辐射剂量均匀。商业处理条件下,目标是努力获得尽可能均匀的剂量。在TAMU校园的eBeam设施里,某商业宠物食品产品的DUR是1.78。II阶段猪开食全价料(5g量)的试样制备在50ml塑料离心管当中,之后每管加入1ml的PED病毒。混合之后,加了病毒的饲料被放在个别的塑料袋中。这些塑料袋先被压扁以便去除空气,并且里面均匀地装着薄薄一层饲料样。这些袋子经过三重密封,以便符合eBeam辐射设施的生物安全规程。这些密封的袋子被放在冰上夜间运至得克萨斯农工大学得克萨斯试验站的国家电子射线研究中心。

进行了初步的剂量投放试验,以便确定实现目标剂量的适宜的传送带速度和其它指标。到达当天,这些样本接受10, 20, 30, 和50 kGy的目标eBeam剂量。一个对照样也随辐射样一同运输,但不接受该设施的eBeam辐射。处理之后,样本(包括对照)置冰上经夜间运输运回明尼苏达大学(圣保罗)。到达时,立即用前述洗脱液洗脱样本。本试验仅实施了一次。

饲料添加剂对饲料中PED病毒存活率的影响

将5g饲料试样置于塑料闪烁管当中。按饲料添加剂制造商的推荐剂量在该5g样本中加入添加剂。在不同饲料试样中加入了下列添加剂:0.015 g的Ultracid P(Nutriad,比利时Dendermonde)、0.02 g Activate DA(Novus国际,密苏里州圣查尔斯)、0.01 g酸化促进剂(农业营养公司,威斯康星州DeForest)、0.01 g KEM-GEST(Kemin农业食品公司,衣阿华州德梅因)、0.02 g砂糖(购物者价值,明尼苏达州伊甸大草原),以及0.02 g商品食盐(每日必需,明尼苏达州伊甸大草原)。再用另一套闪烁管来作为不加任何饲料添加剂的配对对照。添加剂加入对应试管之后,每管再加入1 ml的PED病毒,之后涡流搅拌。所有闪烁管在室温(本试验进行的季节室温为25°C左右)下孵化。孵化0、1、3、5、7、14和21天之后,用3%牛肉提取物洗脱液对存活病毒进行洗脱。试验重复实施。每个试验采用一套三个重复样本,三个样本结合,用于一个单一的滴定并进行细胞接种。

试验结束之后,对每个带添加剂和不带添加剂的饲料样本溶液进行测量。每个5g饲料样加50ml去离子水之后用磁铁搅拌器室温搅拌15分钟,测量pH值。搅拌之后,用一个pH探头测量液体的pH值。pH测量试验设置三个重复。除pH之外,还比较了活性 DA(艾维酸DA,2-羟基-4-甲基硫丁酸)、KEM-GEST(磷酸、甲酸、乳酸、和柠檬酸)、糖(蔗糖)、酸化促进剂(磷酸、柠檬酸、和乳酸)、食盐(氯化钠)、以及Ultracid P(正磷酸、柠檬酸、甲酸、以及苹果酸)等添加剂的有效成分进行了比较。

统计分析

灭活动力学数据(log TCID50/mL)用GInaFiT分析,这是由Geeraerd等人开发的微软Excel免费插件。传统的假定病毒浓度与处理时间之间存在log-线性关系模型由Bigelow和Esty开发,通过这个模型,采用下列问题来分析PED病毒存活曲线:

设N为处理之后的存活病毒滴度(以TCID50/mL表示),N0为最初的病毒滴度(TCID50/mL),k是动力学参数(分钟-1或天-1),t为处理时间(分钟或天)。动力学参数k通常表达为D值,又称为90%灭菌时间(某温度下降初始病毒滴度log值降低1或病毒浓度降低90%的时间),按下式计算:

韦泊尔分布函数一直被用来描述各种微生物在不同热处理或非热处理之后的非线性灭活规律。假定该病毒对温度的抵抗力符合韦泊尔分布,Mafart等人开发了下列韦泊尔方程:

设N为处理之后的存活病毒滴度(以TCID50/mL表示),N0为最初的病毒滴度(TCID50/mL),δ是病毒种群滴度第一次对数降低的时间(分钟或天),n是形状参数。n值对曲线形状提供了总体的描述;如果n > 1,那么曲线就是凸的(构成肩峰形),如果 n < 1, 那么曲线就是凹的(构成尾巴形),如果n = 1,那么曲线为直线,并且可用线性模型描述。

通过下列方法计算调整R2 (Adj. R2 )值,用两个有效重复来评估该模型与实验数据的符合程度:

其中m是观察数,j是模型参数个数,SSQ是平方和。

图 1. 全价料当中PED病毒经热处理的灭活。全价料当中灭活曲线由韦泊尔模型在120°C、130°C、140°C和145°C温度下得出。

采用SAS(SAS仪器,北卡罗莱纳Cary)混合过程进行方差分析来确定不同处理间的统计学差异。采用图奇校正的最小均方来确定不同处理均值之间的差异,P < 0.05视为显著。该试验单位为组合三重复试管中获得的值。固定效应为所选温度或饲料添加剂。

结果

PED病毒的加热灭活

图1展示120°C、130°C、140°C和145°C下病毒浓度(log TCID50/mL)作为时间的函数。存活曲线显示了非线性行为(肩峰),说明需要一定的暴露时间才能将病毒灭活。表2显示了每个温度下对数-线型和韦泊尔模型(D值和Delta值)。PED病毒在干燥饲料样本中表现了高耐热性,而每个样本中完全灭活(3个log的降低)可在30分钟内实现。饲料样本中最初的水分含量为8.57%(W/V)。就爱如1ml病毒介质之后水分含量提高为23.8%(W/V)。这种水分含量的改变有可能增加了热处理灭活病毒的效果。因为热灭活在高水分含量的条件下更有效,这一点先前已经在牛细小病毒对湿热比干热更加敏感的试验中获得了展示。

表 2. 饲料中PED病毒的热灭活动力学方面的对数-线型模型与韦泊尔动力学参数以及拟合度的比较。

图 2.通过eBeam辐射处理对PED病毒进行灭活。全价料当中PED病毒灭活曲线由韦泊尔模型在eBeam辐射处理下得出。

韦泊尔模型产生的校正R2值更大(0.76至0.84)高于对数线型模型(0.64至0.84),为实验数据提供了更好的拟合。Delta值随温度增加而降低,说明灭活率提高。要想获得5个log的病毒衰减,120°C、130°C、140°C和145°C下的预期时间估值分别为82.6、14.2、10.5和6.5分钟。除120°C之外,所有的时形状参数(n)均大于1,说明出现了图1灭活曲线中展示的那种肩峰。130°C、140°C和145°C下的Delta值统计差异不显著(P > 0.05)。

电子射线处理对PED病毒的灭活效果

图2显示了电子射线处理灭活PED病毒的效果。该图显示的是韦泊尔模型预测的灭活曲线,各点为观察值。采用韦泊尔模型估算的Delta值为17.25 kGy。PED病毒的存活率依赖于剂量,剂量增加的情况下灭活效果也会提高。要想获得饲料中5个log的PED病毒衰减,需要86.25 KGy的剂量。

饲料添加剂对PED病毒灭活的效果

饲料(对照样本)和含添加剂的饲料当中的病毒浓度如表3所示。饲料样本中添加这些添加剂会降低初始病毒滴度。表 4分别展示了对数-线型模型和韦泊尔模型的D值和delta值。采用韦泊尔模型可以得到比对数线性模型更大的校正R2值,因此,韦泊尔模型被用来对室温下添加了添加剂的饲料当中PED病毒的存活率进行定性分析。除Ultracid P和食盐之外的所有样本的Delta值都显著低于对照样本(P < 0.05),说明灭活病毒的动力学过程更快(表4)。室温(25°C)之下21天孵化之后,含有KEM-GEST、食糖、以及食盐的样本观察到了3个log的降低。在相同的21天孵化阶段当中,活性DA处理组观察到2个log的降低,而对照组、Ultracid P和酸化促进剂处理组的降低小于2个log。

表 3. 加与不加饲料添加剂的饲料的PED病毒浓度比较

表 4. 添加不同添加剂的饲料中PED病毒的存活率动力学方面的对数-线型模型与韦泊尔动力学参数以及拟合度的比较。

表5展示了不同活性成分和pH值的所有饲料添加剂之间的比较。总的来说,含有磷酸的添加剂降低病毒浓度的效果更好。唯一含2-羟-4-甲基硫丁酸(活性DA)的添加剂在降低病毒浓度方面的效果最强。这些不同的添加剂加入之后,饲料样本的pH值也有不同。

讨论

加拿大第一家猪场PED检测结果呈阳性的时候,据推测饲料是传播PED病毒的载体。之后进行的流行病学调查显示,断奶猪饲料配方中使用的一批喷雾干燥猪血浆(SDPP)为潜在的PED病毒感染来源。在一次生物实验当中,经证实,一份污染的SDPP样本能够感染生猪,然而,当加到全价料当中之后,没有更多的生猪被感染。这有可能是因为稀释的效果,或者因为从病毒污染到生物分析之间的时间较长。对俄亥俄一起PED病毒爆发进行的调查当中也得出了类似的结论,也就是饲料或饲料原料可能是PED病毒在猪场之间传播的载体。那次爆发的情况下,在一家存在母猪感染的猪场的饲料里通过RT-PCR检到了病毒。在后续的生物分析当中,没有任何生猪食用污染饲料之后出现感染。在这项研究中,未发现造成饲料污染的来源,尽管PED病毒RT-PCR检测结果为阳性。Dee展示,实验条件下用PED病毒RNA污染的饲料经猪只自然采食之后会造成活跃的感染。参考资料的搜集显示,如果全价料碰巧遭到PED病毒污染,那么该污染饲料有可能会造成猪场的活跃的感染。作为总结,这些结果显示,还需要更多研究来评估各种通过加工方式来控制PED病毒经饲料传播的潜在的缓解策略。

表 5.选用饲料添加剂的组成与属性

先评估了120至145°C持续0至30分钟热处理对饲料中PED病毒存活率的影响。先前的研究都专注于80°C以下的温度对PED病毒存活率的影响。一项研究发现,某个细胞培养弱化PED毒株在50°C、30分钟处理之后保持相对稳定,50°C处理与对照相比仅降低了0.4log10 PFU/mL。进一步调查显示,60至80°C处理30分钟可致PED病毒完全丧失感染力,但该研究并未报导log值的降低。在另一项研究当中,粪便中的野毒株在71°C下只需10分钟的处理即可灭活到丧失感染或猪能力的程度。这些病毒灭活效果的不同可能是由于受试样本的水分含量不同造成的。在热处理过程中,水分含量绝对会影响病毒的存活率。

尽管这些研究当中的暴露时间和温度各不相同,但其结果都与先前的数据相符,显示PED病毒是一种低热稳定性病毒。我们的假设是,猪饲料加工过程中的热处理会降低PED病毒的存活率。这个假设已经由我们的试验结果证明,120°C下暴露25分钟可将PED病毒含量降低3个log(99.9%)。这些结果也凸出了一项发现,那就是超过130°C以上的温度并不会加强PED病毒的灭活。这是一项重要的观察,因为高蛋白饲料原料的过度加热会因梅拉德反应降低氨基酸的消化率。除了高温处理后饲料中PED病毒的对数减少之外,韦泊尔模型产生的灭活曲线肩峰也有助于确定PED病毒在高温条件下的存活率。灭活曲线中观察到的肩峰现象可能说明病毒对一定范围内的温度-时间组合是有抵抗力的,而要想实现显著的灭活,需要超过一定的门限。该曲线肩峰的另一个可能的原因是,当室温下的接种物加入饲料样本的时候,饲料被冷却。这将意味着,饲料被放回烘烤炉后的前几分钟被用来将温度回升到炉温,这可以解释病毒浓度为什么会出现平台。总的来说,我们的这些试验结果结果证实了,全价饲料中的PED病毒含量能够通过热处理的方式降低。

在探索非热处理降低饲料中PED含量的方法过程中,发现50 kGye的Beam辐射可有效将病毒含量降低3 log(99.9%)。当前,食药管理局(FDA)已经规定了动物饲料离子辐射剂量上限为50 kGy。在美国,经证实eBeam处理动物饲料与膳食可有效灭活病原。动物饲料和包装袋(重约20kg)都例行采用eBeam进行处理。都有流程控制措施来测量这些样本袋的最大和最小剂量,以便满足客户需求并且遵从管理规定。尽管我们已经展示了,eBeam处理能够有效降低猪饲料当中PED病毒的含量,但未来还需要更多研究,在不同类型的饲料当中验证本研究得到的结果。我们的试验数据显示,50 kGy的剂量可将PED病毒含量降低大约3 log10,这个结果很重要,因为它强调了通过遵从良好生产流程来确保饲料加工过程中的低病毒负载的重要性。这些结果说明,如果初始PED病毒生物负载大于4 log10 TCID50,那么FDA强制的50 kGy剂量上限可能不足以实现这些饲料中病毒的完全灭活。除了通过更多研究来调查最高PED病毒滴度之外,可能还有必要调查个别饲料原料的辐射用量。我们的试验仅测量了辐射对猪全价料的影响,因此无法证实同样的结果是否也适用于单独的饲料原料。

最后,我们评估了按生产商推荐剂量添加不同饲料添加剂的情况下饲料中PED病毒的存活率。仅在室温下进行了添加剂试验。在一家猪场,饲料的存储温度可能会因季节、料仓布局、袋装还是散装、料仓温度以及其它变量而变化。本试验中室温被当作一种灵活的平均温度,尽管它无法精确地适用于每种情形。饲料被建议存储在凉爽、干燥的地方,因此很可能有些猪饲料的存储温度会低于本试验当中大约25°C的试验温度。

已经显示,日粮添加有机酸饲料添加剂可降低pH值并改变肠道微生物区系,从而提高养分消化率,这又最终能够提高生长性能,并提供了断奶猪日粮中使用的抗生素的替代方案。有机酸已经被用来降低细菌性病原的流行率,例如家禽饲料中的沙门氏菌。在另一项试验当中,一种抗菌产品SalCURB,这种产品一直被用来控制饲料中的沙门氏菌,它被试验用来降低饲料中活性PED病毒的效果。在这项试验中,生物分析显示,SalCURB处理过的饲料未能在幼稚猪当中造成感染。至于SalCURB如何灭活PED病毒的提议方法并未见报。PED病毒存活率的差异不仅在添加剂存在的情况下出现,而且也在不同饲料原料存在的情况下出现。一项实验测定了18中不同的饲料原料,经确定,PED病毒的在原料中的存活率是饲料原料特异性的,在豆粕中观察到了更高的存活率。这说明,甚至像饲料原料更换那样不起眼的改变都可能影响病毒在饲料中的存活率。

已经报导,PED病毒在pH6.5至7.5、温度37°C条件下保持稳定。由于肠道病毒必须能够经受胃酸的条件,所以它们总的来说对酸性pH值耐受力较强。尽管如此,外部环境如果持续较长时间偏离最佳pH值的话,也会增加病毒的灭活。先前一篇综述报导,添加有机酸(甲酸、柠檬酸、柠檬酸钠、烟酸、甲酸钠,或苹果酸)可以将饲料平均pH值从5.96降至4.71。据假设,使用添加剂的情况下日粮pH值的这种降低会降低PED病毒的存活率。我们研究的结果并不必然支持这项假设。活性DA和KEM-GEST是降低病毒存活率最有效的两种添加剂,但它们也是pH值最低的添加剂,这一点证实了最初的假设。然而,Ultracid P与KEM-GEST相比在日粮pH方面并没有差异,然而它在所有评估的添加剂当中delta值最高。此外,pH值要想发挥作用,必须要有水加入饲料才行,因为干燥的基质没有pH值。在本试验当中,1mL病毒介质被加入样本当中然后混合。这意味着病毒样本刚刚加入的时候介质的pH值可能会因添加剂而改变。假如这个单一的改变可以解释我们试验当中存活率的差异的话,那么在饲料溶液的pH值与观察到的delta值之间应该有更明显的规律才对。鉴于pH与病毒存活率之间的规律不够清晰,而且有些情况下使用添加剂的饲料和对照饲料的溶液pH值之间无差异,因此肯定有其它的因素造成了不同饲料添加剂之间的病毒存活率的差异。

饲料添加剂当中还有其它的组分具有降低PED病毒存活率的能力,因为仅凭pH值的差异无法解释PED存活率降低的情况。我们假设,特殊的活性组分在各个添加剂造成的病毒存活率降低当中扮演了角色。许多不那么有效的添加剂都含有柠檬酸和乳酸作为活性组分。先前已经展示,柠檬酸和乳酸只有中度的抗菌活性,因为它们唯一的效果是降低环境pH值。因为大部分猪饲料都具有中性pH值,那么含柠檬酸的添加剂在灭活PED病毒方面没什么效果就毫不意外了。相比之下,甲酸据显示抗菌效果非常强,并且在降低E. Coli.(大肠杆菌)存活率方面特别有效。还没有任何已发表的研究显示甲酸具有抗病毒的效果,但它是KEM-GEST的成分,而后者实现了本研究中PED病毒的第二低的存活率,这说明它可能能够有效降低PED病毒的存活率。活化DA也可有效降低PED病毒的存活率。活化DA的有效成分,本研究中最有效的添加剂,是2-羟-4甲基硫丁酸。作为低蛋氨酸猪日粮当中的一种低成本高效益的添加剂,这个组分得到过专门的研究。尽管它并未获得批准用作抗菌或抗病毒药剂,但我们的研究结果显示,它具有降低病毒存活率的潜力。总的来说,要想降低全价猪饲料当中的PED病毒存活率,就需要仔细挑选最有效的活性成分。有必要展开进一步研究来探索各种活性组分的相对效果及其之间可能具有的相互作用。

我们在这个实验中的局限在于,水的作用是个未知数。通过在样本中加入液体介质,水分含量已经显著增加。这会影响湿度,从而有可能改变了高温对病毒产生的灭活效果,而这种效果在低水分条件下可能并不存在。已经显示,与干燥血浆产品相比,液体介质在热处理和pH改变条件下的PED病毒灭活效果是不同的。因为我们的试验既研究了添加剂实现的pH改变的效果,也研究了热处理的效果,我们的接种过程造成的水分增加可能会带来与不加介质的干燥饲料不同的灭活动力学特征。此外,没有对环境湿度进行控制,并且没有测量样本中水的活动。没有这些参数,就无法确定水在饲料样本PED病毒灭活当中扮演的角色。除了水的效果未知之外,本试验还存在病毒初始滴度低的局限。因此就不可能达到完全灭活的标准(典型情况下是7个log的降低),因为初始病毒滴度仅有4个log。

我们的结果显示,通过eBeam处理或130°C以上的热处理可以降低PED病毒存活率。使用某些饲料添加剂也能够有效降低病毒水平,但还需要进一步研究来确定PED在商业性猪饲料当中的流行率和最高滴度,以便确定最适合的处理参数(热处理的时间和温度,eBeam处理的剂量,以及选用的饲料添加剂),从而实现最有效的PED病毒灭活。

结论

据说明,饲料是PED病毒传播的潜在载体。这就要求我们对新的和现有的降低饲料中PED病毒存活率的加工方法进行评估。本研究的结果显示,在低病毒滴度(6.8x103 TCID50/mL)的条件下,热处理(130°C至少15分钟)和非热处理(50 kGy eBeam剂量)饲料处理技术可以消除99.9%PED病毒的感染力。此外,通过选用酸化剂和有机酸添加剂也可以降低猪饲料当中PED病毒的存活率。

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